Comment calculer la concentration de l'ARN

Quantifier votre échantillon d'ARN par mesure de son absorption de la lumière ultraviolette (UV). Un spectrophotomètre nano-goutte utiliser seulement un ou deux microlitres de votre échantillon, que vous pouvez récupérer. Autres spectrophotomètres exigent un échantillon beaucoup plus large. Le coefficient d'extinction de nucleotides à une longueur d'onde d'UV de 260 nm dans un trajet de lumière de 1 cm est de 20. Sur la base de ce coefficient d'extinction, l'absorbance de 40µ-g / ml d'ARN dans les mêmes conditions est une. En utilisant cette information, vous pouvez calculer la concentration de votre échantillon d'ARN.


Sommaire

  • Instructions
  • Choses que vous devez

    • Spectrophotomètre
    • Calculatrice

    Instructions

    1. Faire une dilution, si nécessaire, de votre échantillon. Une dilution standard pour une microcuvette est de 1:40. Faire de cette dilution en ajoutant 2µ-ARN échantillon L à 78µ-L de l'eau stérile.

    2. Suivez les protocoles de votre spectrophotomètre notamment pour calibrer la machine en utilisant un vide, puis déterminer la densité optique de votre échantillon à une longueur d'onde de 260 nm UV.

    3. Multipliez l'absorbance de l'échantillon par votre facteur de dilution de 40&mu-ARN g / mL. L'équation serait: "concentration de l'ARN (µ-g / ml) = (DO260) x (facteur de dilution) x (40µ-ARN g / ml) / (DO260 une unité)" (Hofstra.edu) Par exemple: Si vous diluée votre échantillon par 1:40 et votre lecture de l'absorbance était de 0,08, vous multipliez 0,08 x 40 x 40 = 128 µ-g / ml = 0,13 µ-g /&mu-L

    4. Figure sur la pureté de l'échantillon en prenant une autre lecture de l'absorbance à la longueur d'onde 280 nm UV. Le ratio DO 260 / DO 280 indiquera si - et à quel niveau - votre échantillon est contaminé avec des protéines ou du phénol. Un résultat de 1,8 à 2,0 indique l'ARN de qualité.

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